服务内容

• 交付内容：高表达单克隆细胞株（1×10⁷cells/ml,1ml）或 cell pool（1×10⁷cells/ml,1ml）；克隆载体；质检报告；实验流程报告；

• 周期：cell pool，8周；单克隆细胞株，12周

稳定细胞系筛选流程

1. 细胞准备

      提前两周准备CHO细胞，保证细胞处于高活力和良好的状态

2. 质粒构建

      您提供序列，我们进行密码子优化，基因合成，构建质粒。在稳定转染之前，我们会先瞬时转染表达评估。

3. 转染

      电转，提前准备细胞，质粒，和确定转染条件。
      电穿孔转染原理：通过电场作用，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核中。在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复合物进入细胞质内，开始瞬转，同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。DNA进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。

4. Cell pool筛选

      转染48小时之后，使用筛选培养基进行cell pool的筛选。培养，并挑选高表达的cell pool，放大培养，冻存高表达的cell pool。

5. 加压筛选单克隆

      挑选最高表达的cell pool，有限稀释法进行单克隆筛选，铺板密度为0.5-1 cell/well，铺板15天后，显微镜观察，标记单克隆，挑选阳性克隆，进行批培养和稳定性检测。

      我们选用GS系统，MSX筛选，逐渐提高药物的浓度，进行多轮次的压力筛选，以提高基因的表达水平。

6. 表达量评估

      将96孔板细胞扩增至六孔板，按4×10⁵cells 接种，一周后收集上清进行检测，评估表达量，根据检测结果，挑选10个最高表达的克隆进行批培养和稳定性测试。

7. 批培养&稳定性测试

      相同密度细胞接种到摇瓶，每天取样计数，进行ELISA检测，确认生长和表达曲线。相同密度的细胞接种到摇瓶，每隔48小时，取样计数，按照相同的密度继续接种，最后进行ELISA检测，确认细胞表达稳定性。稳定性测试进行50代。